大肠杆菌多粘菌素耐药表型及耐药基因调查开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

大肠杆菌是1885 年由德国科学家Escherich发现的，此后大肠杆菌即用这位发现者的名字命名^[1]。大部分大肠杆菌属于哺乳动物和禽类肠道内的正常菌群，少数大肠杆菌具有致病性，称之为致病性大肠杆菌 (Pathogenic E.Coli)。根据毒力因子、发病机制及病变的不同，大肠杆菌可分为肠道致病性大肠杆菌(Intestinal Pathogenic E.Coli)和肠道外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic E.coli，ExPEc)^[2]。肠道外致病性大肠杆菌包括尿道致病性大肠杆菌(uropathogeuLo E.coli，UPEC)、新生儿脑膜炎大肠杆菌(Nconatalmeningitis E.coli，NMEC)和禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic E.coli，APEC)。

大肠杆菌病既可以单一感染，又可与多种疾病混合感染或继发感染，因此可以引起极高的死亡率，给养殖业带来重大损失^[3]。疾病危害主要表现为肝周炎、卵黄性腹膜炎、大肠杆菌性败血症以及心包炎等，大肠杆菌还可以通过污染鸡蛋、蛋制品以及通过耐药性的传播进而威胁人类健康^[4]。近年来，耐药菌株的增加以及耐药谱的不断扩大已经成为大肠杆菌病难以控制的一大原因^[5]。各项研究表明，致病性大肠杆菌对四环素类和氟喹诺酮类药物都有比较高的耐药性^[6,7,8]，如刘书亮^[9]等对动物性食品中分离的319株大肠杆菌进行药物敏感性检验，结果显示这些大肠杆菌对喹诺酮类的耐药率均大于95%；周洪艳^[10]对从哈尔滨某鸡场分离的大肠杆菌用微量稀释法测定了18种抗生素的最小抑菌浓度和14个耐药基因，研究结果表明所有菌株对12种抗生素都有很强的耐药性，其中最敏感的药物是喹诺酮类的环丙沙星药物，并且从大肠杆菌中检测出tetA、tetC、ermC、blaCTX-M、intI和blaNDM-1共6个耐药基因，检出含tetA的阳性菌株最多，含blaNDM-1阳性菌株最少；王冠玉^[11]等对分离自贵州的鸡源大肠杆菌耐药性分析显示，分离菌对9 种抗生素表现耐药；邓春朋^[12]用药敏纸片法对从13个不同规模化鸡场分离的135株鸡源大肠杆菌进行药敏实验，结果表明对氟喹诺酮类的环丙沙星、诺氟沙星和左氧氟沙星的耐药率较高。

多粘菌素是由土壤多粘芽孢杆菌产生的聚阳离子脂肽抗生素，通过与革兰阴性菌外膜脂多糖的带负电荷的脂质体A成分相互作用，破坏细菌外膜，从而导致细胞裂解和死亡^[13,14,15]。包括大肠杆菌在内的革兰阴性菌多重耐药现象的出现，使得多粘菌素这一阳离子肽抗生素作为治疗的手段越来越被重视^[16,17,18]。然而，随着多粘菌素在临

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

从致病性大肠杆菌对多粘菌素的耐药表型、相关的耐药基因分布情况进行调查研究。

研究内容：

3. 研究的方法与方案

研究方法：

1.采用药敏试验检测大肠杆菌对多粘菌素的耐药情况分布。

2.采用PCR检测大肠杆菌耐药基因。

3.对PCR扩增产物进行测序，分析大肠杆菌耐药基因分布情况。

技术路线：

实验方案：

1.材料

1.1菌株

由实验室保存从各地患病动物分离纯化出的致病性大肠杆菌400余株，标记编号后在-40℃环境下保存待用。

1.2 抗生素

多粘菌素B药敏纸片购自于温州市康泰生物科技有限公司。

1.3 培养基

Mueller-Hinton（MH）培养基、Luria-Bertani（LB）液体培养基。

1.4 试剂与器材

Tag DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸、十二烷基硫酸钠(SDS)、溴化乙锭、琼脂糖、ddH₂O、PCR管、移液枪、枪头、2mL EP管、PCR管架、EP管架、PCR仪（购自于BIOMATRA公司）、电泳槽、琼脂糖凝胶电泳成像仪（凝胶成像系统购自于美国伯乐BIO-RAD公司）、一次性手套、棉签、酒精灯、镊子、PCR Master Mix（购自于诺唯赞生物技术公司）、DNA Marker（购自于Takara公司）

2.方法

2.1菌液的准备

分别将400余株大肠杆菌由冻存管中取出20μL菌液接种于1mL LB液体培养基中，37℃培养12h后，用灭菌生理盐水将菌液稀释至OD₆₀₀为0.1左右（相当于0.5个麦氏浓度）

2.2 培养基的制备

Mueller-Hinton琼脂的制备：根据产品说明用干粉培养基制备，121℃高压灭菌15min后，控制温度40-50℃之间，将平皿水平放在超净台上，倾倒平板，控制琼脂厚度约为4mm。待平板凝固冷却至室温时，放入冰箱保存，平板需在7d内用完。

LB液体培养基的制备：每1L液体培养基中含950mLddH₂O，10g胰蛋白胨（tryptone），5g酵母提取液（yesat extract），10g氯化钠，用1M的NaOH调节PH至7.0，定容至1L后121℃高压灭菌15min，4℃储存备用。

2.3 药敏试验

WHO推荐的琼脂纸片扩散法（改良Kirby.Bauer法，K-B法），根据抑菌环直径大小与最低抑菌浓度的相关性，结合临床上已知敏感或耐药菌株的状态，得到可靠的药敏结果。用无菌棉拭蘸取经过稀释后的菌液，均匀涂布于制备好的MHA营养琼脂表面。待平板上的菌液水分被琼脂完全吸收后再用无菌镊子小心夹取药敏纸片贴于平板（纸片间距25mm，距离平皿边缘16mm），贴上以后可以用镊子轻压一下纸片，使其与培养基表面贴牢，然后置37℃恒温孵箱培养16-18h后，读取药敏结果。用游标卡尺量测量抑菌环的直径3次，以肉眼见不到细菌明显生长为限，计算出的平均值即为试验结果。依据CLSI（Clinical and Laboratory Standard Institute）标准（表1）对大肠杆菌的耐药性结果进行统计，以敏感（Susceptible）、耐药（Resistant）三种形式报告结果。

表 1 肠杆菌科用的抑菌圈直径解释标准

Table 1 The explain standard of Enterobacteriaceae

inhibition zone

注：R为耐药； S为敏感

Note：R means resistant；S means susceptible

2.4 引物设计

引物合成参照相关参考文献，PCR引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。引物序列及相关参数见表2：

表2 多粘菌素B耐药基因的PCR扩增引物核酸序列

Tabl 2 Polymyxin B resistance genes nucleic acid sequences

of the PCR amplification primers

2.5多粘菌素耐药基因的检测

根据表2多粘菌素药物相关耐药基因lpxA、lpxC、lpxD、pmrA、pmrB、phop、phoQ、mgrB设计的特异性引物，以药敏试验中得到的致病性大肠杆菌菌株为模板，进行PCR扩增，检测相关基因在该大肠杆菌中的分布，PCR总反应体系为25uL，具体如下：

2Taq Master Mix 12.5uL

引物1（上游引物） 1uL

引物2（下游引物） 1uL

DNA模板（菌液）2uL

ddH₂O Up to 25uL

PCR反应程序如下：

93℃（预变性） 3min

93℃（变性） 45s

60℃（退火） 45s 30 cycles

72℃（延伸） 45s

72℃（延伸） 7min

PCR扩增结束后进行琼脂糖凝胶电泳。最后根据琼脂糖凝胶电泳结果，对比目的条带大小，统计400余株大肠杆菌中的耐药基因种类和数量。

2.6对PCR产物进行测序分析

将PCR产物进行测序，并将测序结果与NCBI数据库中敏感菌株MG1655的相应基因进行比对，分析这些耐药相关基因的突变情况。

可行性分析：

1. 大肠杆菌对多粘菌素的耐药表型及耐药基因调查

采用药敏试验检测大肠杆菌对多粘菌素的耐药情况分布、PCR检测大肠杆菌耐药基因、对PCR扩增产物进行测序等技术已运用得比较成熟，本实验室已形成一套成熟的技术路线，试验技术上完全可行。

2.条件可行

本实验室是农业部细菌学重点实验室，具有先进的试验仪器设备，并具有理论及实践经验丰富的教师，能对本试验给予很好的指导，因此在试验条件上完全可行。

3.方案可行

本研究设计合理，方法先进，技术路线正确，因此可行。

4. 研究创新点

深入研究致病性大肠杆菌对多粘菌素的耐药性，具有重要的临床用药指导意义。本研究主要从致病性大肠杆菌对多粘菌素的耐药表型、相关的耐药基因分布情况进行调查研究，使用实验室保存的480株大肠杆菌，分析其对多粘菌素的耐药性、耐药机制及检测多粘菌素耐药基因的分布情况。

5. 研究计划与进展

1.2016.9-11

进行药敏实验，调查大肠杆菌中耐药菌株的分布情况；

2.2016.11

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