脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测方法的建立开题报告

 2023-02-15 10:18:06

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)是一种重要的人畜共患病病原，属于微RNA 病毒科心病毒属，是一种无嚢膜的单股正链RNA病毒。该病毒宿主广泛，可以引起多种动物及人的以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要特征的急性传染病。鼠类是EMCV 的自然贮存宿主和传播者，猪是其感染最广泛和最严重的动物，临床上主要引起母猪繁殖障碍及断奶仔猪的脑炎、心肌炎、急性死亡，死亡率最高可达100%[1、2]，同时成年猪感染后多以亚临床形式存在。EMCV最早于1945年从美国佛罗里达州一只患急性心肌炎死亡的黑猩猩体内分离得到[3]，1958年，EMCV引起仔猪致死性心肌炎，并首次被报道[4]。之后在意大利、希腊等多个国家都出现了该病的暴发和流行。我国于2005年首次从病死仔猪和流产胎儿中分离到EMCV病毒[5]。由于脑心肌炎会造成大量仔猪死亡、母猪流产、产弱胎、死胎等，因而该病的发生与流行给世界养猪业都造成了巨大的经济损失，严重影响了养猪业的健康发展。盖新娜等[6]对该病毒感染的血清学调查表明，EMCV感染在我国规模化猪场广泛存在。近年随着异种器官移植的兴起，猪作为人类器官移植的重要供体动物，EMCV 对人类健康的隐患也受到越来越多的关注[7]。

目前，针对脑心肌炎病毒的诊断方法有多种，主要有两大类：一类是分子检测技术，包括放射性探针原位杂交技、RT-PCR、实时定量荧光PCR等，这些方法具有简便、特异、快速和敏感性强的特点。另一类则是血清学检测技术，包括酶联免疫吸附试验、血凝抑制试验、血清中和试验和琼脂凝胶沉淀试验等，血清学诊断方法快速、简便，可用于大规模检测诊断和流行病学调查。Vlemmas等[8]建立了免疫组织化学方法，可以直接检测组织中的病原体分布，但检测成本高，且制备病理组织样品过程复杂。近年，我国开展了许多有关抗体检测方法的研究，樊得英等[9]应用重组的EMCV VP1、VP2、2C蛋白建立了一种双抗原夹心方法来检测病毒抗体。

EMCV的衣壳蛋白由4 种结构蛋白VP1、VP2、VP3 和VP4组成，其中VP1抗原性最强，是EMCV基因组中最重要的中和性抗原表位所在区域，其氨基酸序列与致病性密切相关[7], 可作为抗EMCV感染的保护性抗原。建立EMCV VP1蛋白间接ELISA抗体检测方法，可对大量临床血清进行检测，且操作简单快捷，具有良好的特异性和灵敏性，对EMCV隐性感染和感染早期诊断具有重要意义。

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2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标

本研究旨在利用原核表达系统表达EMCVVP1蛋白，建立脑心肌炎病毒的间接ELISA抗体检测方法，并进行条件优化，为其临床检测的标准化奠定基础。

2. 研究内容

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3. 研究的方法与方案

1.研究方法及实验方案

（1）EMCV VP1基因引物的设计和合成

根据EMCV VP1基因序列设计特异性引物，并在其5端和3端分别添加EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ限制性酶切位点。引物由上海英维捷基公司合成。以实验室已有的pET-

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4. 研究创新点

VP1作为EMCV抗感染的重要保护性抗原，围绕其展开的研究逐渐成为一个热点。虽然以VP1为目的抗原的间接ELISA抗体检测方法已初步建立，但其反应条件并没有得到充分优化。本研究则在原有研究基础上对抗原包被浓度、血清稀释度、血清孵育时间、酶标SPA稀释度、作用时间以及避光显色时间等条件分别做了进一步的优化，为EMCV间接ELISA抗体检测方法的标准化奠定基础。

5. 研究计划与进展

2016.9~2016.10查找阅读相关文献，学习并熟练掌握原核表达、蛋白纯化以及间接ELISA操作技术。

2016.11~2017.1 构建pET-32a-VP1重组质粒，并诱导表达及蛋白纯化，完成EMCV VP1间接ELISA抗体检测条件的优化。

2017.2~2017.4 整理总结试验数据，归纳分析并完成论文撰写。

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