1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.蒺藜苜蓿遗传转化的研究进展
蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）是豆科苜蓿属一年生植物，也被称为截形苜蓿或截叶苜蓿。蒺藜苜蓿之所以被选为豆科模式植物，是因为它具有生长期短 (80-100 d)、染色体组小 (2n=16)、基因组小 (454-526 Mb)、遗传转化效率高、自花授粉和共生固氮等特点。蒺藜苜蓿与紫花苜蓿的亲缘关系很近，两者基因组间具有很高的同源性，因而借鉴蒺藜苜蓿的研究结果及其基因资源对促进紫花苜蓿和其它豆类作物遗传改良具有重要意义。
根癌农杆菌是普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌，它可以趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，从而引起植物的根瘤病害。1977年，Chilton等证明根癌农杆菌Ti质粒的一部分可以转入植物细胞，并且能够整合到植物染色体上。随后，根癌农杆菌介导的转化方法逐级趋于成熟。1996年，Trieu等通过生态型Jemalong A17芽器官发生途径首次成功获得转化再生植株。1999年，Rose等建立了生态型Jemalong 2HA的高频再生系统。2007年，Cosson等使用生态型R108发展了一种更有效的通过体胚发生途径进行遗传转化的方法。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标
蒺藜苜蓿作为豆科的模式植物，是研究豆科植物与根瘤菌共生互作信号调控机理的理想材料。根毛的变形对于结瘤因子介导的根瘤菌侵染植物的过程非常重要。RIC家族是植物特有的一类小G蛋白ROP的下游效应子，参与ROP信号途径对细胞的极性生长的调控。蒺藜苜蓿ROP10被报道通过调控结瘤因子诱导的根毛变形参与根瘤菌侵染过程中。本研究的目标是构建蒺藜苜蓿RIC家族的成员之一RIC8的基因敲除载体，并导入蒺藜苜蓿中，为研究其在结瘤因子诱导的根毛变形过程中的功能奠定基础。
研究内容
3. 研究的方法与方案
研究方法和实验方案
1.RIC8基因敲除载体的构建
采用华南农业大学长江学者刘耀光教授建立的CRISPR/CAS9系统（见：Ma et al. 2015. A robust CRISPR/Cas9 system for convenient, high-efficiency multiplex genome-editing in monocot and dicot plants. Molecular Plant 8: 12741284），该系统可以对单个基因的多个靶点进行突变，平均突变效率为85.4%，纯合突变占24.7%，在T1代就能出现表型。选择RIC8的非保守序列的2个位点作为突变位点。
4. 研究创新点
传统转基因技术是外源基因进入植物细胞后随机整合到植物基因组中，进而获得相应的目标性状。但是由于插入位点的随机性，会产生许多不利结果，如植物内源基因的破坏、外源基因沉默等现象。由于在植物中产生自发同源重组的概率很低，对植物基因组进行精确修饰和改造非常困难，位点特异性核酸酶的出现和应用，大大提升了同源重组的效率，使基因组编辑变得更加高效和精确，从而使得对包括植物在内的任何物种进行基因组编辑都将成为可能。
CRISPR/Cas9技术自2013年初开始成功应用以来，已迅速应用于多种生物的研究，其在基因编辑中的优越性是显而易见的，相较于传统的转基因技术而言是高效、精准的，相对于基于TALENs\ZFNs的基因编辑技术而言，其操作更加简便，敲除效率更高，基因编辑更加精准，大大降低了脱靶机率。CRISPR/Cas9植物基因敲除能够适用于几乎所有植物细胞的基因修饰研究。而且该技术操作相对简单、花费低，在普通实验室就可以使用，它的出现为植物基因工程的研究提供了一个新的想法和思路，将会在植物基因组的定向编辑研究中作出巨大的贡献，带来突破性的发展。
5. 研究计划与进展
1.2016年12月：完成RIC8基因敲除载体的构建
2.2017年1月2017年3月：共培养、愈伤组织的形成
3.2017年3月2017年5月：胚的形成、植株的发育、植株抗逆性的检验
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