1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
蒺藜苜蓿具有生长周期短、基因组小、遗传转化率高、自花授粉等特性，并且蒺藜苜蓿和包括紫花苜蓿在内的大部分豆科植物有遗传上的相似性，在蒺藜苜蓿获取的信息可用于其它豆科植物，因此蒺藜苜蓿作为豆科模式植物，可以最大限度地满足豆科植物生物学和遗传改良研究的需要。特别是蒺藜苜蓿可以建立起有效的分子遗传和反向遗传学的分析研究体系,这对豆科作物的研究尤为重要。
已经有研究表明,水稻和拟南芥WRKY基因家族存在较明显的基因复制现象,而苜蓿中这一现象并不是很明显,此外,苜蓿28个基因在7条染色体都有分布,相对于拟南芥和水稻而言分布不集中,说明了苜蓿基因组中WRKY基因复制事件较少,这可能是苜蓿WRKY基因较少的原因之一。此外,苜蓿WRKY基因的同源性较高,在进化树上分布相对集中,而水稻WRKY基因差异较大,不少基因分布在进化树外围,苜蓿相对水稻而言,WRKY基因较为保守。
WRKY蛋白是新发现的一类序列特异的转录因子，由于具有高度保守的WRKY域而得名。WRKY结构域位于蛋白的N端，包含一个WRKYGQK核心序列和一个Cx4-5Cx22-23HxH或Cx7Cx23HxC型锌指基序。根据WRKY-锌指基序的数量和结构，WRKY蛋白最初被分为三个类别。第Ⅰ类型WRKY蛋白具有两个Cx4Cx22-23HxH锌指基序，第Ⅱ类型WRKY蛋白具有一个Cx4-5Cx22HxH锌指基序，被研究过的大部分WRKY转录因子都属于第Ⅱ类。第Ⅲ类型WRKY蛋白只有一个WRKY结构域，Cx7Cx23HxC是它的锌指基序。在研究分析中，第Ⅱ类WRKY蛋白又被进一步分为五个亚类，分别是Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe。
2. 研究的基本内容和问题
目标:（1）提取蒺藜苜蓿的RNA，反转录成cDNA，克隆得到MtWRP1全长序列
（2）MtWRP1序列与豆科植物基因序列进行同源比对
（3）分析MtWRP1基因在蒺藜苜蓿不同组织器官中表达特性
3. 研究的方法与方案
研究方法:（1）采用RNA Plant Extraction Kit试剂盒提取RNA
（2）反转录cDNA第一链合成
（3）合成引物：采用Primer Primer5软件设计引物并合成
（4）用CIRCOS 软件(Krzywinski et al.2009)对其基因全长序列进行比较
技术路线：
一．
合成cDNA第一链 |
设计正反引物 |
提取RNA |
基因克隆得到基因全长序列 |
二．定量分析：
（一）基因在不同组织器官中的表达量
提取不同组织器官RNA |
分析基因表达量 |
反转录合成cDNA |
（二）不同时期叶片中基因的表达量
提取叶片不同时期RNA |
合成cDNA第一链 |
分析基因表达量 |
实验方法：
（一）实验目的：
（1）通过提取蒺藜苜蓿的RNA，反转录成cDNA，克隆得到MtWRP1全长序列
（2）MtWRP1序列与豆科植物基因序列进行同源比对
（3）测出MtWRP1基因在蒺藜苜蓿不同组织器官中表达量
（4）测出MtWRP1基因在叶片不同时期的表达量
（二）实验材料：
实验室种植的蒺藜苜蓿R108种植于南京农业大学生长室，本研究采用的日照周期为16h光照8h黑暗。
（三）实验步骤：
1.基因克隆
（1）总RNA的提取
RNA提取方法：采取TRIZOL法，使用北京天根公司的RNA Plant Extraction Kit(DP419)试剂盒提取样品RNA，步骤如下：①取50-100 mg样品放入研钵，加入液氮快速研磨成粉状。加入1ml裂解液RZ，匀浆后转移至离心管中。②室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。③4℃15000g离心5min。小心取上清液，转入新的离心管中。④加入200μl氯仿，剧烈涡旋混匀30g，室温静置3min。⑤4℃15000g离心15min，样品分为三层：黄色有机相、中间层和无色的水相，RNA主要存在于水相，约为500μl。将上层水相转移至新的离心管中。⑥缓慢加入0.5倍体积的无水乙醇，轻轻混匀。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR中，4℃15000g离心1min，弃掉收集管中的废液。⑦向吸附柱CR中加入500μl去蛋白液RD（使用前需加入乙醇），4摄氏度15000g离心1min，弃废液。⑧向吸附柱CR中加700μl漂洗液RW，4℃15000g离心1min，弃废液。⑨向吸附柱CR中加500μl漂洗液RW，4℃15000g离心1min，弃废液。⑩将吸附柱CR放入收集管中，4℃15000g离心2min，去除残余液体。
（2）RNA的纯化和检测
对总RNA样品进行DNAaseⅠ消化和苯酚/氯仿抽提纯化，消除基因组DNA污染。用1％琼脂糖凝胶进行电泳，检测总RNA的质量和浓度。若看到非常明显的三条带:28S rRNA，18S rRNA及5S rRNA，且28S rRNA的亮度为18S rRNA的两倍，说明完整性良好。弥散状或看不到条带意味着总RNA严重讲解。
（3）cDNA第一链的合成
反转录形成cDNA第一链。
反转录步骤：
①在Microtube中配置下列反应混合液
试剂 | 使用量 |
Oligo d(T) Primer（50 μM） or Random 6 mers （50 μM） | 1 μl 1 μl(0.4-21 μl)*1 |
DNTp Mixture（10 mM each） | 1 μl |
模板RNA | Total RNA:5 1 μg以下 Poly（A） RNA：μg1以下 |
RNase free dH2O | Up to 10 μl |
②65C保温5min后，冰上迅速冷却。
③在上诉Microtube管中配置下列反转录反应液，总量为20μl。
试剂 | 使用量 |
上述变形后反应液 | 10μl |
5PrimeScript Ⅱ Buffer | 4μl |
RNase I | 0.5μl(20U) |
RrimeScript Ⅱ Rtase (200U/μl) | 1μl(200U) |
RNase free dH2O | Up to 20μl |
④缓慢混匀。
⑤按下列条件进行反转录反应：
（30 10min） （使用Random 6 mers 时）
42℃（-50C）*2 30-60min
⑥95℃ 5 min*3 （酶失活）后，冰上冷却。
（4）合成正反引物
（5）基因克隆
2.序列分析与同源比对
3.定量分析：
（1）不同组织器官的表达量
①分别从蒺藜苜蓿根茎叶花果实种子中提取RNA
②反转录得到cDNA
③根据MtWRP1基因序列设计引物，对蒺藜苜蓿根、茎、叶、花、果实、种子进行定量分析
④得到不同组织器官中WRKY基因的表达量
（2）叶片不同时期的表达量
①取不同时期蒺藜苜蓿的叶片，提取RNA
②反转录得到cDNA
③根据MtWRP1基因序列设计引物，对蒺藜苜蓿不同时期叶片的表达量进行分析
④得到不同时期其叶片的基因表达量
可行性分析：
理论分析：我们已经学习了植物学、植物生理学、牧草栽培与管理及牧草及饲料作物育种学等专业课，阅读了相关的文献资料，掌握了相关的理论知识。
研究方法分析：我们已掌握了相关技术，而且试验方法为常规方法，操作方便。
实验条件：本实验在草业工程研究室进行，已具备相关的仪器设备。在实验资金方面有学校的科研经费和老师的资助。
4. 研究创新点
WRP是豆科特有的高度保守蛋白，具有特殊的结构域，在拟南芥、水稻等植物中并没有找到同源基因的文献报道，目前只有在大豆中报道过，然而，对WRP的调控功能和作用机制研究还处于起步阶段，因此对蒺藜苜蓿MtWRP1的研究能进一步揭示其功能。
5. 研究计划与进展
研究计划：
①准备好实验花盆及适合蒺藜苜蓿生长的土壤，在每个花盆内放入已配好的基质。
②适宜的时期在每一个花盆内播撒适量蒺藜苜蓿的种子，精心管理，注意防杂草虫害。
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