1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
不结球白菜(Brassica campestris.SSPchinensis(L)Makino)俗称白菜、青菜,是我国南北方普遍栽培的大众化蔬菜,特别在南方长江中下游较多。据调查，不结球白菜占长江中下游各大城市蔬菜总产量的30～40%,占当地蔬菜复种面积的40-60%[1]。而病毒侵染、高温干旱、冷害等逆境胁迫影响作物的生长发育，严重损害不结球白菜的经济价值，因此利用现有种质资源改良培育优良不结球白菜品种具有重要意义，而鉴定与筛选相关抗逆基因是其重要环节。建立高效不结球白菜转化体系是基因功能鉴定和培育转基因不结球白菜新品种研究的重要组成部分。芸薹属其他作物在转基因技术研究上都取得了很大的进展，如甘蓝(B.oleracea)、芥菜(B.juncea)、油菜(B.napus) [2～3]等，但由于白菜具有AA基因组，与同为芸薹属的黑芥BB基因组和甘蓝CC基因组相比，其外植体离体培养再生能力最低，遗传转化存在一定的困难[4]。近年来，在大量学者的努力下，不结球白菜再生频率有所提高[5]。目前已成功的转基因植物有80％是采用农杆菌转化法，这种方法也是最成熟、最理想的双子叶植株转基因方法 [6]。不结球白菜的遗传转化也主要采用农杆菌介导的方式。农杆菌介导转基因的原理是：农杆菌从植物伤口侵入后，进入植物细胞时，可将自身的一段转移DNA插入受体细胞，因此利用DNA体外重组技术构建含目的基因的重组质粒，用含重组质粒的农杆菌侵染植物，便可以实现将目的基因整合到植物细胞中的目的。在农杆菌介导的组织培养中，植物的分化再生频率受到外植体基因型和类型、培养基成分、激素浓度和配比、培养条件等多种因素的影响。外源激素诱导愈伤组织形成，影响愈伤组织分化，因此研究合适的激素浓度和配比对提高遗传转化再生频率至关重要。钱迎倩按激素作用性质将其分为二大类: 一类主要是促细胞分裂,如激动素(kienitn)、6-苄基嘌呤(6-BA)等。另一类是主要促进细胞生长和RNA及蛋白质的合成等作用,如吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、 2,4一二氯苯氧基乙酸(2,4一D)等[7]。愈伤组织诱导和愈伤组织分化大多情况下都需要同时添加生长素和细胞分裂素。在愈伤组织诱导阶段, 添加外源生长素优先考虑次序为NAA、IAA、2,4-D。常用对植物细胞毒害作用较轻，浓度范围在0.01～10mg/L的NAA和IAA诱导外植体产生愈伤组织，NAA诱导效果比IAA好，2,4-D对植物细胞有一定毒性，一般较后考虑，[8]。6-BA、噻苯隆(TDZ)、 KT等是愈伤组织诱导中常使用的细胞分裂素[8]。6-BA 能促进细胞分裂, 有利于愈伤组织的形态建成；噻苯隆(TDZ)处理可诱导嘌呤细胞分裂素的积累和合成，从而诱导愈伤组织生长、扩张和再生[9]；KT在一定程度上可以延缓衰老，有利于改善愈伤组织的质量[10]。 在愈伤组织分化阶段，最常用生长素（NAA 或 IAA) 和细胞分裂素( KT和 6-BA)配合完成形态建成。在形态建成过程中，除了植物激素的类型外,生长素和细胞分裂素的配比对愈伤组织的分化具有更为重要的意义，比值高利于根形成, 反之则利于茎芽发生。
不结球白菜高效再生体系的建立在国内外学者的共同努力下有了可喜的进展。陈敏敏以暑绿、苏州青、亮自叶和矮抗5号四个不结球白菜品种为材料，结果暑绿的再生频率为12．50％；苏州青再生频率为11．11％；亮白叶的再生频率最低，优势组合为：以暑绿为材料，种子发芽培养基中添加TDZ，子叶一子叶柄为外植体，接种于MN 0．5 mg/L-TDZ 0.5 mg/L-NAA 7.5 mg/L AgNO3 [11]。谢建坤试验以5～9日龄苗子叶为外植体,以MS BA-6mg/L NAA-0.05mg/L AgNO3-5mg/L GA3-3mg/L为诱导分化培养基建立的白菜子叶离体再生体系中，品种‘苏州青’不定芽诱导频率最高,为77.1% [12]。吕艳艳以不结球白菜品种亮白叶为实验材料，MS 6-BA-5.0mg/L NAA-0.1mg/L AgNO3-4.0mg/L为分化培养基，得到了59.5%的再生频率[13]。
参考文献：
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
以不结球白菜‘苏州青’为材料，在分化再生培养基中添加不同种类和浓度配比的外源激素。研究不同外源激素种类及浓度配比对农杆菌介导的遗传转化率的影响，探索优化不结球白菜遗传再生体系。
3. 研究的方法与方案
研究方法用培养（5、6、7、8）天的带柄子叶和下胚轴为外植体，采用农杆菌介导的方法，不断调整分化培养基中激素的种类和浓度以及添加AgNO3，并在分化培养基中加入相应的筛选类物质，从而得到再生的芽，统计不同组合不定芽再生频率，确定再生频率最高的组合，优化不结球白菜再生体系。
技术路线
研究方案1.1 供试材料
以不结球白菜品种 ‘苏州青’为材料，种子来自上海推广品种和南京农业大学园艺学院白菜课题组。
1.2 无菌苗的培养
种子用70 %酒精消毒1 min，再用次氯酸钠处理，无菌水冲洗干净后，接种于1/2 MS培养基培养。
1.3 不定芽诱导和筛选
待无菌苗培养5、6、7、8天，以带柄子叶和下胚轴为外植体材料，分别接种于含不同浓度的生长素与细胞分裂素组配的MS分化培养基中（附加一定浓度的AgNO3和抗生素），筛选适宜的激素浓度配比和外植体类型。外植体接种后置于培养条件为光照12 h、光强2000~3000 lx、温度25 ℃的培养箱，25 d后调查不定芽分化率和生芽质量。
不定芽分化率=（分化不定芽外植体数/接种外植体数）×100%。
若长出健康的芽苗且长度达1.5~2.5 cm时，再进行诱导生根，培育完整植株。
可行性分析
（1）试验材料丰富且有一定基础
本项目依托南京农业大学园艺学院白菜课题组自主品种和上海投入生产的品种‘苏州青’，为本项目的开展提供了材料保证。不结球白菜品种‘苏州青’，在之前的分化培养研究中表现较好，可以有效避免基因型对再生频率的影响。
（2）实验技术成熟
依托课题组已经建立了较为成熟的农杆菌介导转基因技术，实验室已经初步建立了不结球白菜再生体系，本研究是在此基础上进行再优化。
（3）实验条件完善
项目依托课题组为园艺学院白菜课题组，该单位具备承担本课题所需的设施设备，包括超净台和培养箱等设备，保证了项目的顺利实施。。
综上所述，本项目主要研究内容所涉及的技术、材料、前期研究和设施均具有良好的基础，因此是切实可行的。
4. 研究创新点
本项目的创新之处：完成全基因组测序的白菜作为十字花科基因组测序的重要蔬菜作物，今后将会有越来越多关于白菜基因功能的研究，而这又依赖于高效的白菜遗传转化技术。本项目的意义在于通过对影响农杆菌介导的分化体系的外源激素的研究，建立高效分化体系。为验证白菜基因功能技术提供有效的的平台，对研究白菜基因组功能具有重要意义。
5. 研究计划与进展
研究计划：2018年9月-11下旬阅读相关文献，熟悉试验流程，学习试验操作。进行了三次完整的试验流程操作2019年2月下旬-3月上旬
设计试验，设置不同的激素浓度和配比。完成三批材料播种，预培养与共培养步骤，并完成中期检查报告的提交。
2019年3月中旬
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