1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
课题意义：
小麦是世界上重要的粮食作物之一，其富含淀粉、蛋白质等营养物质，可用来生产面包、馒头等主食，具备重要的营养价值。我国是世界上小麦生产、消费大国，主产区有黄淮冬麦区、西北春麦区以及新疆西藏冬春兼种麦区等十大麦区。
小麦白粉病是由白粉病菌(Blumeria graminis f. sp. tritici)引起的一种世界性真菌病害。小麦产生白粉病后，光合作用减少，呼吸和蒸腾作用加剧，养分大量流失，导致严重减产。近年来，世界主要麦区白粉病的危害日趋严重，由次要病害上升为主要病害[1]。
2. 研究的基本内容和问题
研究的目标、内容和拟解决的关键问题：
研究目标：
1.对Pm21在小麦抗病通路中与哪些蛋白有互作进行初步筛选，获得候选基因。
3. 研究的方法与方案
研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析
研究方法：
1.克隆候选基因
根据目的基因序列，设计引物，通过进行PCR、胶回收、连接拓扑载体、大肠杆菌连接转化、挑取单克隆做菌液pcr一系列步骤，送去公司测序比对，验证测序成功即成功克隆目的基因。
2.构建候选基因VIGS载体
根据候选基因的序列设计引物，进行PCR扩增、胶回收DNA产物。
利用Nhe 1 酶切γ-PDS载体，获得γ-片段
克隆候选基因的VIGS片段和NheI酶切后的γ-片段进行体外同源重组，连接构建目的基因的BSMV重组载体
将连接后的产物进行转化培养，挑取单克隆做菌液pcr，送公司测序验证载体是否构建成功。
3.病毒载体线性化
将BSMV病毒载体α、β、γ-空、γ-PDS以及成功连接有目标基因片段的重组载体进行高纯度质粒提取，应用于载体的线性化。
其中α、γ载体用MluI，β用SpeI分别进行线性化酶切。
取1μL上述线性化产物稀释10倍，分别用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，确保酶切各质粒模板已完全线性化。
纯化酶切完全后的线性化产物。
4.体外转录
将经过线性化纯化的质粒作为模板，进行体外转录。
将体外转录产物稀释10倍，分别用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，并测定浓度。
转录产物置于-80℃保存备用，用于接种实验。
5.病毒接种
将包含与Pm21互作基因目标片段的利用大麦花叶病毒诱导基因沉默（BSWV-VIGS）技术，表达载体涂抹至二叶期小麦叶片上以沉默筛选出有功能的互作基因。
培养一批繁菌苗，适时完成对沉默植株进行的白粉病菌接种。
6.剪下具有病毒表型的叶片，脱色后用考马斯亮蓝染色，观察离体鉴定叶片，并在显微镜下微观观察菌丝发育情况，统计菌丝数量。
技术路线：
筛选Pm21互作基因
↓
有功能的互作基因 → 回补验证
↓
构建病毒载体
↓
繁菌苗 → 接种苗
↓
功能解析
实验方案：
1.材料种植
2018年10月，种植92R137材料于宜兴，10月20日播种。常规田间管理。
获得酵母AH109菌株（Trp,Leu,His,Ade表达缺陷菌株）
2.候选基因和VIGS载体片段扩增pcr体系：2xPhanta Mix
| Mix | 5.0μL |
| ddH2O | 3.2μL |
| F/R | 0.4/0.4μg |
| 模板up to | 10μL |
PCR程序为：94℃预变性3min，95℃高温变性15s，57℃退火15s，72℃延伸2.5min，共35个循环，72℃延伸5min，10℃保存。
3.候选基因和VISG载体菌液pcr体系，2xTaq体系
| Mix | 3.6μL |
| ddH2O | 5.0μL |
| F/R | 0.2/0.2μg |
| 模板up to | 10μL |
PCR程序为：94℃预变性3min，93℃高温变性30s，52℃退火45s，72℃延伸2min，共32个循环。72℃延伸10min，10℃保存。
4.拓扑载体连接体系：
| PCR产物 | 0.5-8μL |
| 拓扑载体 | 1.0μL |
| 10xEnhancer | 1.0μL |
| ddH2O up to | 10μL |
5.体外同源重组体系
| 5xCE Buffer | 2.0μL |
| 目的基因 | 20-200ng |
| γ载体 | 50-200ng |
| ExnaseII | 1.0μL |
| ddH2O up to | 10μL |
6.大肠杆菌连接转化步骤
（1）将感受态在冰上放置1min溶解，轻弹混匀
（2）将10μLDNA产物加入感受态中，冰置25min
（3）42℃热激90s
（4）冰置2min，加800μLLBO摇45min-1h
（5）离心5000x3min，准备涂布材料
（6）倒掉上清液，余100μL左右，吸至平板上，涂布过夜培养
7.重组载体酶切体系
（1）重组病毒载体、α、γ、γ-空及γ-PDS病毒载体质粒线性化体系如下。37℃孵育6h。
| 10×H Buffer | 5.0μL |
| Mlu（10U/μL） | 2.0μL |
| 质粒DNA | 2.0μg |
| DEPCH2O up to | 50μL |
（2）β病毒载体线性化体系如下，37℃孵育6 h。
| 10×M Buffer | 5.0μL |
| Spe1（10U/μL） | 2.0μL |
| 质粒DNA | 2.0μg |
| DEPCH2O up to | 50μL |
8.体外转录体系，37℃孵育4h。
| Buffer | 2.0μL |
| γNTPs | 3μL |
| 线性化产物 | 2.0μL |
| DEPCH2O | 1.25μL |
| Cap | 0.75μL |
| T7Enzyme up to | 10μL |
9.病毒液混合体系
| α | β | γ | DEPCH2O | Buffer | 总体积 | 可接苗 |
| 1.0μL | 1.0μL | 1.0μL | 9μL | 12μL | 24μL | 3颗 |
| 2.0μL | 2.0μL | 2.0μL | 18μL | 24μL | 48μL | 6颗 |
| 3.0μL | 3.0μL | 3.0μL | 27μL | 36μL | 72μL | 9颗 |
| 4.0μL | 4.0μL | 5.0μL | 36μL | 48μL | 96μL | 12颗 |
| 5.0μL | 5.0μL | 5.0μL | 45μL | 60μL | 120μL | 15颗 |
10.接种病毒操作步骤
在小麦第二叶完全抽出，两叶齐长时选择生长良好的小麦植株，戴上无粉乳胶手套，用移液枪吸取8μL混合液到食指上，使拇指和食指轻轻接触，蘸取混合液，利用摩擦接种法涂抹（注意用力适当）小麦第二叶基部来回摩擦，直至手指上混合液用尽。每个载体独立接种，不同的接种植株用不同的工具进行标记。标签写上小麦材料、接种人姓名与接种日期。
可行性分析：
本课题组从事小麦抗白粉病机制研究已有多年，满足上述所需的实验材料与相关方法仪器设备。所需材料92R137供应足够，本人也已掌握上述技术，熟悉实验流程。
4. 研究创新点
本课题利用抗白粉病Pm21位点编码CC-NBS-LRR的NLR1-V基因，以CC结构域为诱饵，更简易高效的筛选出互作基因。采用VIGS技术，研究周期短，不需要遗传转化，可在不同的遗传背景下生效，相对于传统的基因功能分析方法更简单、快速、有效以及实现高通量。
5. 研究计划与进展
2018年7月-2018年8月
学习和掌握实验室基本实验操作，阅读相关文献资料，锻炼自己的实验技能、完善实验背景知识。
2018年9月-2018年10月
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